powrót do strony głównej
Łukasz Kozłowski
Kielce 2006

ANALIZA FILOGENETYCZNA HISTONÓW

ŁĄCZNIKOWYCH KRĘGOWCÓW

SKRÓTY I SYMBOLE STOSOWANE W TEKŚCIE

B4 (H1M) histon Xenopus laevis charakterystyczny dla okresu bruzdkowania
BIONJ  ulepszona wersja metody NJ
BLOSUM macierz substytucji sekwencji białkowych
d  oczekiwana liczba substytucji nukleotydowych na miejsce dla dwóch sekwencji
F81 model substytucji nukleotydów zaproponowany przez Felsensteina w 1981 roku
FM (Fitch-Margoliash) jedna z metod odległościowych
GTR (general time reversible) model substytucji nukleotydów zakładający odwracalność ewolucji
H1 klasa histonów silnie lizynowych
H1° histon H1 charakterystyczny dla komórek zróżnicowanych
H1a-e histony H1 charakterystyczne dla komórek somatycznych
H1oo (oocyte-specific linker histone) histon łącznikowy specyficzny dla oocytów
H1t (testis-specific histone H1) histon H1 specyficzny dla jąder
H1X histon Bufo japonicus homologiczny do B4
H2A klasa histonów umiarkowanie lizynowych budująca rdzeń nukleosomu
H2B klasa histonów umiarkowanie lizynowych budująca rdzeń nukleosomu
H3 klasa histonów arginowych budująca rdzeń nukleosomu
H4 histon arginowy wchodzący w skład rdzenia nukleosomu
H5 histon silnie lizynowy charakterystyczny dla jądrzastych erytrocytów
HKY (Hasegawa-Kishino-Yano) model substytucji nukleotydów
HTH (helix-turn-helix) motyw helisa-skręt-helisa
J69 najprostszy model substytucji zaproponowany przez Jukesa i Cantora w 1969 roku
JTT macierz substytucji aminokwasów autorstwa Jones, Taylor, Thornton
K2P  (Kimura 2 parametr) model substytucji o dwóch parametrach
LS (last squares) metoda ostatnich kwadratów zaliczna do metod odległościowych
ME (minimum evolution) metoda minimalnej odległości (ewolucji)
ML (maximum likelihood) metoda największej wiarygodności
MP (maximum parsimony) metoda największej oszczędności
MSA (multiple sequence alignment) dopasowanie wielu sekwencji
NJ (neighbor joining) metoda przyłącznia najbliższego sąsiada, zaliczna do metod odległościowych
p różnica między proporcją poszczególnych aminokwasów/nukleotydów w obrębie dwóch sekwencji
PAM  model akceptowalnych mutacji punktowych; także macierz substytucji aminokwasów oparty o ten model
PC (Poisson corection) poprawka wartości d uwzględniająca rozkład Poissona
PDB (Protein Data Bank) bank sekwencji i struktur białkowych
pN substytucje niesynonimiczne (zmieniające odczyt aminokwasu)
pS  substytucje synonimiczne (nie zmieniające odczyt aminokwasu)
pz par zasad
R współczynnik określający stosunek tranzycji do transwersji
REV odwracalne modele ewolucji sekwencji, np. JC69, HKY, F81
Scoredist logarytmicznie skorygowana wartość odległości d
siRNA (small interfering RNA) mały interferujący RNA, klasa RNA o długości 21-28 par zasad
T92 model substytucji nukleotydów zaproponowany przez Tamurę w 1992 roku
UPGMA  (unweighted pair-group method using aritmetic averages)  metoda nieważonych średnich połączeń zaliczna do metod odległościowych
VT  (variable time model) model substytucji aminokwasów ustalona  przez Mullera i Vingron
WAG  (Whelan-and-Goldman)  model substytucji aminokwasów

1. WSTĘP

    Białka histonowe należą do wysoce konserwatywnych białek obecnych w większości organizmów eukariotycznych, a ich homologi występują również u Procaryota (Kasinsky i wsp., 2001). Białka te znajdują się w jądrze komórkowym, gdzie wiążą się z DNA tworząc podstawową jednostkę chromatyny jaką jest nukleosom. Struktura ta składa się z ośmiu cząsteczek histonów stanowiących rdzeń na który niemal dwukrotnie obwinięty jest DNA o długości ≈ 146 pz. Histony można podzielić na dwie podrodziny białek. Są to histony rdzeniowe i histony łącznikowe. Do histonów rdzeniowych zaliczane są białka H2A, H2B, H3 i H4. Każde z nich występuje podwójnie w nukleosomie tworząc tetramer H32-H42 i dwa dimery H2A-H2B, które z kolei łączą się w oktamer (Rys. 1). Białka te mają budowę modularną i składają się z trzech części: COOH-terminalnej, centralnej i NH2-terminalnej. Rdzeń nukleosomu budują jedynie dwie pierwsze domeny, podczas gdy części N-terminalne wystają na zewnątrz nukleosomu. Pomimo swej konserwatywności ewolucyjnej (histony należą do najwolniej się zmieniających białek) histony wykazują pewne zróżnicowanie, jedynie histon H4 występuje w formie jednorodnej. Drugą podrodzinę stanowią histony łącznikowe obecne w większej liczbie wariantów i szybciej ewoluujące niż pozostałe histony. Białka te ulokowane są w miejscu w którym DNA wchodzi do i wychodzi z nukleosomu stanowiąc swego rodzaju klamrę spinającą całość (Ramakrishnan, 1997; Kłyszejko-Stefanowicz, 2002; Luger i Hansen, 2005; Chakravarthy i wsp., 2005).
spis treści

1.1. BUDOWA HISTONÓW ŁĄCZNIKOWYCH

    Histony łącznikowe to małe, silnie zasadowe białka o masie około 21 tys. Da. Zaliczamy tu histony H1 powszechnie występujące we wszystkich rodzajach komórek jądrzastych oraz histony H5 specyficzne dla jądrzastych erytrocytów ptaków  i płazów. Białka te podobnie jak histony rdzeniowe zbudowane są z trzech domen (Tabela 1). Część centralna (zwana też globularną) zbudowana z około 80 aminokwasów cechuje się najwyższą konserwatywnością (Wierzbicki, 2002; Kasinsky i wsp., 2001). Domena globularna składa się z wiązki trzech α-helis oraz β-harmonijki (nazywanej w tym przypadku skrzydłem) ulokowanej w pobliżu C-końca. Ze względu na taką budowę histony łącznikowe zaliczyć można do rodziny białek HTH, choć typowe białka HTH takie jak CAP (białko aktywatora katabolicznego) mają między drugą a trzecią helisą skręt zbudowany z czterech aminokwasów, którego brak u histonów (Ramakrishnan, 1997). Motyw uskrzydlonej helisy decyduje o możliwościach wiązania się do DNA, a różnice w składzie aminokwasowym między histonami H1 i H5 skutkują odmiennym powinowactwem tych form do DNA (Gajiwala i Burley, 2000).
Część N-terminalna zbudowana jest z 35-40 aminokwasów z dużą ilością aminokwasów zasadowych oraz proliny i alaniny. Dodatkowo domenę tą można podzielić na dwie części: zewnętrzną silnie hydrofobową i sąsiadującą z domeną centralną część zasadową. W obrębie struktury drugorzędowej można tu wyróżnić dwie α-helisy oddzielone dwoma glicynami dzięki którym motyw helisa-Gly-Gly-helisa jest elastyczny. Ponadto helisy te są silnie alifatyczne czyli aminokwasy zasadowe położone są z jednej strony, zaś zasadowe z drugiej oraz zawierają potrójne miejsca zasadowe co jest cechą białek wiążących DNA takich jak protaminy (Vila i wsp., 2002). Należy podkreślić, że wyżej opisana struktura drugorzędowa dotyczy jedynie części zasadowej i występuje jedynie w obecności DNA (Vila i wsp. 2001). Domena COOH-końcowa histonu H1 jest najdłuższa i zbudowana jest z 90-160 aminokwasów wśród których przeważają lizyna, arginina i prolina, które stanowią ponad 85% aminokwasów histonu H1 co powoduje niemal 15-krotną przewagę aminokwasów zasadowych nad kwasowymi  (Kłyszejko-Stefanowicz, 2002). Dodatkowo często występują seryna i treonina będące miejscem fosforylacji. Innym specyficznym motywem są sekwencje (S/T)PXX, gdzie X oznacza lizynę lub argininę. Motyw ten decyduje o możliwości wiązania się do mniejszego rowka DNA (Ramakrishnan, 1997). Podobnie jak domena N-końcowa,  ogon C-terminalny nie wykazuje struktury drugorzędowej, chyba, że połączy się on z DNA lub będzie stabilizowany przez specjalne związki takie jak trifluoroetanol czy NaClO4. W takich warunkach powstaje kilka alifatycznych α-helis przedzielonych β-skrętem lub σ-skrętem dzięki czemu histony łącznikowe mogą się wiązać zarówno z mniejszym jak i większym rowkiem DNA (Vila i wsp., 2000).
spis treści

1.2. FUNKCJA HISTONÓW ŁĄCZNIKOWYCH

    Podstawową funkcją histonu H1 i H5 jest stabilizowanie zwartej struktury nukleosomu. Brak histonów łacznikowych zmienia budowę chromatyny, która staje się luźna, a nukleosomy ją budujące pozbawione są charakterystycznej struktury łodyżki. Uniemożliwia to wykształcenie następnego stopia konformacji przestrzennej jakim jest 30 nm włókno, które przez wiele lat opisywano jako solenoid, ale obecnie coraz częściej przedstawia się według modelu wstęgi zygzakowatej (Bednar i wsp., 1998; Travers, 1999). Oprócz tej wydawałoby się czysto mechanicznej funkcji histony łacznikowe podlegają licznym modyfikacją takim jak fosforylacja, ubikwitynacja, acetylacja, ATP-rybozylacja i metylacja co ma duże znaczenie dla regulacji ekspresji genów (Kłyszejko-Stefanowicz, 2002). Przykładowo fosforylacja motywu SPKK w C-terminalnej części wpływa na zdolność wiązania się histonu H1 do chromatyny, a siła tego oddziaływania zależy także od lokalizacji danego motywu co sugeruje, że poszczególne sekwencje ulegające modyfikacji nie są równocenne (Hendzel i wsp., 2004). Obecnie zebrane dane jasno wskazują, że funkcja histonów łącznikowych jest daleka od początkowo postulowanej roli generalnego represora ekspresji genów. Można tu zaobserwować istnienie różnych zależności, przykładowo wyciszenie za pomocą siRNA histonów H1 u Arabidopsis thaliana powoduje odziedziczalne zmiany we wzorze metylacji DNA i ekspresji genów (Wierzbicki i Jerzmanowski, 2004)  Sprawa jest na tyle skomplikowana, że postuluje się nawet istnienie specjalnego kodu według którego poszczególne modyfikacje w odmienny sposób wpływają na ekspresję genów, kondensację chromatyny i inne procesy komórkowe (Jenuwein i Allis, 2001; Turner, 2002).
 spis treści

1.3. ZRÓŻNICOWANIE HISTONÓW ŁĄCZNIKOWYCH

    Histony H1 i H5 są białkami najbardziej zróżnicowanymi w całej rodzinie histonowej. Wszystkie do tej pory zbadane organizmy (ponad 100 gatunków roślin i zwierząt) posiadają więcej niż jeden wariant tego białka (Sullivan, 2002).
Najdokładniej zbadano pod tym kątem ssaki u których można wyróżnić co najmniej osiem wariantów: pięć somatycznych (H1a-e) oraz histony H1t, H1oo i H1° (Rys. 2).
    Pod względem budowy genów i białek oraz czasu i miejsca ekspresji histony łącznikowe można podzielić na cztery klasy. Są to:
- warianty, których ekspresja następuje we wczesnym etapie rozwoju;
- warianty występujące w komórkach somatycznych;
- histony łącznikowe związane z procesem różnicowania;
- wariant charakterystyczny dla jąder.
    Histony pierwszej grupy ulegają ekspresji jedynie w intensywnie proliferujących komórkach w okresie oogenezy i na początku embrionezy, a dokładniej mówiąc w czasie bruzdkowania (ang. cleavage linker histones). Początkowo białka te wyizolowano u płazów (wariant B4 zwany też H1M u Xenopus laevis oraz H1X u Bufo japonicus) i bezkręgowców (grupa histonów cs-H1 u Strongylocentrotus purpuratus, Parechnus milaris i Lytechinus pictus). Ich homolog u ssaków wykryto po dość żmudnych poszukiwaniach w oocytach myszy i nazwano H1oo (Tanaka i wsp., 2001). W obrębie promotora brak u nich kasety bogatej w guaninę, kasety charakterystycznej dla H1 oraz kasety CAAT (zamiast niej jest kaseta Y). Sam odcinek kodujący posiada introny, których inne histony nie posiadają, a na końcu odcinka 3' znajduje się sygnał poliadenylacji (Khochbin i Wolffe, 1994; Khochbin, 2001). Odmienność histonów okresu bruzdkowania widoczna jest również na poziomie białka, gdyż są one znacznie dłuższe (273-285 aminokwasów) i słabiej zasadowe (proporcje aminokwasów kwaśnych i zasadowych są niemal równe) od innych histonów łącznikowych (Tanaka i wsp., 2001). Skutkuje to słabszym powinowactwem histonów B4, H1oo i cs-H1do DNA, co może być cechą korzystną w komórkach podlegających częstym replikacjom.
    Somatyczne histony łącznikowe nazywane są histonami zależnymi od replikacji, ponieważ ich synteza zachodzi jedynie w fazie S, występują w większości komórek w tym także w komórkach embrionalnych i oocytach (Clarke i wsp., 1992; Clarke i wsp., 1997). Sekwencje promotorowe zawierają region bogaty w guaninę, kasety TATA i CAAT oraz enhancer zlokalizowany 450-480 pz powyżej czapeczki (tzw. sekwencja bogata w TG; Khochbin, 2001). Somatyczne histony łącznikowe, choć ulegają ekspresji we wszystkich komórkach wykazują różne proporcje. Przykładowo w komórkach proliferujących przeważają histony H1a i H1b, zaś w komórkach zróżnicowanych warianty H1c, H1d i H1e. Podobne zróżnicowanie można zaobserwować w odniesieniu do poszczególnych tkanek (Lennox i Cohen, 1983). Różnice te zależą m.in. od poziomu ekspresji genów, okresu półtrwania mRNA i białek (Wang i wsp., 1997). Różnice sekwencji aminokwasów, które wahają się od 15-40% i powodują odmienne powinowactwo poszczególnych wariantów do DNA i chromatyny. Inne są także miejsca, które ulegają modyfikacjom posttranslacyjnym.
   Przez histony związane z procesem różnicowania należy rozumieć warianty H1° i H5. Pierwszy występuje w zróżnicowanych komórkach somatycznych (mózg, wątroba, płuca), drugi zaś jest charakterystyczny dla jądrzastych erytrocytów. Posiadają one wspólną budowę promotora (Rys. 2) z kasetami H1/AC, GC i nietypową kasetą TATA, brak natomiast sekwencji CAAT zamiast której występuje sekwencja spotykana w promotorze histonu H4 mianowicie 5'TCANNNNGGTCC'3 będąca miejscem wiązania się specyficznego czynnika transkrypcji H4TF2 (dla prostoty pominięto ten fakt na rysunku). Wszystkie te elementy są konserwatywne i silnie oddziaływują na ekspresję genu. Innym elementem kilkakrotnie pojawiającym się w dalszej części promotora wpływającym w znaczacy sposób na poziom ekspresji histonu H1° jest sekwencja (A/C)GGGGGG(A/C) nazywana ścieżką heksadeoksyguaninową (dG)6 (Khochbin i Wolffe, 1994; Dong i wsp., 1995). Dominującą rolę w kontroli ekspresji genu H5 mają trzy elementy promotora: region bogaty w GC, miejsce wiążące USF (ang. USF binding side) oraz element UPE (ang. upstream positive element) zawierający w sobie wyżej wyminiony element charakterystyczny dla histonu H4. Na poziomie mRNA histony te wyróżniają się długimi odcinkami nie podlegającymi translacji flankującymi oba końce transkryptu (5'-UTR i 3'-UTR; Franke i wsp., 1998). Powstające z nich białka zawierają dużo seryny, alaniny i lizyny (wariant H5) lub argininy (wariant H10). Ponadto występuje tu niespotykana u innych histonów łącznikowych treonina i histydyna (Kłyszejko-Stefanowicz, 2002). Jak wspomniano histony ulegają licznym modyfikacjom, a jedna z nich jest zarezerwowana właśnie dla histonu H10, w obrębie którego możemy wyróżnić dwie frakcje w zależności od tego czy histon H1° jest acetylowany na N-końcu czy nie. Ilość histonu H10 i histonu H5 pozytywnie koreluje z kondensacją chromatyny oraz spadkiem replikacji i transktypcji, co związane jest z wysokim powinowactwem tych wariantów do DNA (Koutzamani i wsp., 2002).
  Ostatnią wydzieloną grupę w obrębie histonów łącznikowych tworzy histon H1t specyficzny dla męskich komórek rozrodczych. Transkrypt H1t wykrywa się w stermatocytach I rzędu znajdujących się w profazie I mejozy (środkowy i późny pachyten), zaś produkt białkowy obecny jest do początkowego okresu rozwoju spermatyd, gdzie może stanowić ponad 50% histonu H1. W późniejszym etapie rozwoju komórek plemnikowych histony zostają zastąpione kolejno przez białka TP (ang. transition proteins) i protaminy (Grimes i wsp., 2003). Mimo podobnej budowy promotora jak u wariantów H1a-e histon H1t ulega specyficznej tkankowo i czasowo ekspresji co tłumaczy się istnieniem negatywnych elementów regulatorowych (Wilkerson i wsp., 2002). mRNA nie posiada ogona poli-(A), w miejscu którego znajduje się konserwatywna 26 nukleotydowa sekwencja tworząca strukturę „szpilki do włosów” (ang. hairpin loop), która odpowiada za dojrzewanie i stabilizację mRNA (Dominski i Marzluff, 1999). Na poziomie białka wariant ten cechuje obecność metioniny, której brak u innych histonów H1 (Fantz i wsp., 2001)
   Oprócz wymienionych wariantów nieallelicznych powstałych prawdopodobnie w wyniku duplikacji genów i ich późniejszej specjalizacji w miarę nagromadzenia się różnic w obrębie sekwencji nukleotydowej histony łącznikowe wykazują polimorfizm w obrębie alleli co opisano u wielu gatunków ssaków (Pałyga, 1990) i ptaków (Pałyga i wsp., 2000; Kowalski i wsp., 2004; Górnicka-Michalska i wsp., 2006).

1.4. DOŚWIADCZALNA INAKTYWACJA HISTONÓW H1

    Ze względu na swoje powszechne występowanie i istotną funkcję trudno sobie wyobrazić, aby histony łącznikowe były białkami, których inaktywacja może nie mieć żadnych konsekwencji. Jednak początkowe badania polegające na tworzeniu transgenicznych myszy pozbawionych jednego lub nawet kilku wariantów histonów łącznikowych były pod tym względem dość zaskakujące. Okazało się, że brak jednego wariantu był kompensowany przez inne formy histonów łącznikowych, a zwierzęta nie wykazywały żadnych zauważalnych zmian (Sirotkin i wsp. 1995). Dotyczyło to nawet silnie wyspecjalizowanych wariantów takich jak H1t. Myszy pozbawione tego wariantu (H1t -/-) były w pełni żywotne i co dosyć zaskakujące płodne, również potomstwo nie wykazywało żadnych odchyleń od normy (Fantz i wsp., 2001; Lin i wsp., 2000). Podobnie brak dwóch wariantów nie powodował większych zmian (Fan i wsp., 2001), choć w tym przypadku da się już wykryć subtelne zmiany na poziomie ekspresji niektórych genów, które paradoksalnie w większości polegały na jej obniżeniu (Alami i wsp., 2003). Dla kontrastu brak trzech wariantów histonów łącznikowych powoduje całkowitą letalność na poziomie embrionalnym (Fan i wsp., 2003; Fan i Skoultchi, 2003). Podobne badania przeprowadzone na linii komórkowej DT40 kury przyniosły analogiczne wyniki (Takami i Nakayama 1997; Takami i wsp., 2000).
    Bardziej szczegółowe informacje dotyczące struktury i funkcji histonów łącznikowych można znaleźć w innych źródłach (Kozłowki, 2004).
spis treści

1.5. CEL PRACY: ANALIZA FILOGENETYCZNA HISTONÓW ŁĄCZNIKOWYCH

    Celem niniejszej pracy jest przeprowadzenie analizy filogenetycznej łącznikowych białek chromatynowych (histon H1 i H5) u kręgowców w związku z czym na początek zostaną przedstawione podstawowe wiadomości na temat filogenetyki molekularnej. Analiza filogenetyczna pozwala zbadać stosunki między genami rodziny histonów łącznikowych, które ukształtowały się w czasie ich ewolucji.

2. PODSTAWY FILOGENETYKI MOLEKULARNEJ

    Filogenetyka to dział biologi zajmujący się badaniem relacji między organizmami żywymi w oparciu o podobieństwa w budowie sekwencji nukleotydowych i białkowych. Opiera się ona na założeniu, że wraz z upływem czasu następują zmiany (mutacje) w obrębie materiału genetycznego (DNA), które odzwierciedlają historię organizmu i jego potomków. Pokrewieństwo między analizowanymi sekwencjami przedstawia się w postaci grafu zwanego drzewem.
spis treści

2.1. DRZEWA FILOGENETYCZNE

    Istnieją dwa rodzaje drzew: ukorzenione i nieukorzenione (Rys. 3). Zwykle mamy do czynienia z tymi pierwszym, a różnica między nimi polega na wybraniu w sposób arbitralny tzw. korzenia. Korzeń jest sztucznie utworzonym węzłem i prowadzi bezpośrednio do grupy zewnętrznej czyli najbardziej oddalonej ewolucyjnie od innych sekwencji. Lokalizację korzenia można wyznaczyć opierając się na zasadzie zegara molekularnego lub przez dodanie sekwencji pochodzącej od organizmu odleglejszego ewolucyjnie od każdej analizowanej sekwencji. W obu przypadkach zlokalizowanie korzenia nie jest pewne, ponieważ w pierwszym przypadku zakłada się poprawność działania zegara molekularnego, co oznacza, że nowo powstałe gałęzie ewoluują w takim samym tempie. W drugim przypadku, aby dodać grupę zewnętrzną musimy posiadać pewien poziom wiedzy dotyczący analizowanych sekwencji (Felsenstein, 2004). Czasem informacji takich po prostu nie ma. Można także próbować wyciągać wnioski analizując posiadane dane. Jednym z możliwych rozwiązań może być wykorzystanie niestacjonarnych modeli substytucji w połączeniu z metodami największego prawdopodobieństwa (Yap i Speed, 2005).
Prócz korzenia w drzewie wyróżniamy gałęzie, węzły zewnętrzne (liście), którymi najczęściej są analizowane sekwencje oraz węzły wewnętrzne będące hipotetycznymi sekwencjami pośrednimi między sekwencjami znajdującymi się powyżej miejsca  lokalizacji rozpatrywanego węzła (Rys. 3). Sposób ułożenia poszczególnych gałęzi nazywamy topologią drzewa. Analizując kilka sekwencji należy rozważyć wszystkie możliwe układy, które mogą powstać, uwzględniając, że przestawienie dowolnego węzła nie oznacza zmiany topologii drzewa (Rys. 4).
Ogólnie liczba różnych topologi drzew nieukorzenionych dla N sekwencji wynosi:

(Strimmer, 1997)
Zaś liczba drzew ukorzenionych wynosi odpowiednio:

    Jak widać liczba drzew ukorzenionych dla N sekwencji jest o jeden wykładnik wyższa od liczby drzew nieukorzenionych. Z równań wynika, że ilość możliwych topologii rośnie wykładniczo, tak, że nawet dla względnie małej liczby sekwencji (N) ich ilość szybko dąży do nieskończoności (Tabela 2). Oczywiste jest więc, że badanie pokrewieństwa wielu taksonów wymaga sprawdzenia olbrzymiej ilości możliwych drzew i dla większej liczby sekwencji byłoby zbyt czasochłonne, a wręcz niemożliwe. W związku z tym metody wyszukiwania drzew polegają na zastosowaniu algorytmów heurystycznych, które sprawdzają jedynie niewielką część możliwych topologii dzięki przyjęciu pewnych założeń, które mają za zdanie odrzucić błędne topologie jeszcze zanim zostaną wykonane główne obliczenia.
    W ogólnym założeniu dąży się do pełnego zobrazowania relacji między sekwencjami czego konsekwencją ma być drzewo o strukturze binarnej czyli drzewo posiadające jeden węzeł stopnia drugiego (z dwoma wychodzącymi od niego gałęziami; węzeł ten nazywamy korzeniem), zaś pozostałe węzły stopnia pierwszego (liście) lub trzeciego (węzły wewnętrzne). Czasem jednak dane nie pozwalają osiągnąć takiego układu. W takim przypadku drzewo zawiera węzły o stopniu wyższym niż 3 (Rys. 5). Może to wynikać z różnych przyczyn. Drzewa o nie w pełni rozwiązanej strukturze mogą być wynikiem naturalnie panujących stosunków między analizowanymi genami, gdzie jednocześnie powstają więcej niż dwa geny (politomia twarda) lub są błędem wynikającym z zastosowanych danych (nieodpowiednie lub/i za krótkie sekwencje; politomia miękka). Ogólnie przyjmuje się, że w większości przypadków mamy do czynienia z politomią miękką (Cotton, 2003).
    Oprócz graficznej reprezentacji drzew można je zapisać w zwięzłej formie przy użyciu nawiasów. Taki zapis jest szczególnie korzystny w czasie porównywania odległości między poszczególnymi topologiami, która dla binarnych drzew nieukorzenionych równa się podwojonej liczbie węzłów wewnętrznych którymi różnią się analizowane drzewa. Przykładowo drzewo ukorzenione zilustrowane na rysunku 5 można zapisać jako (D (C (B (A, E, B)))), zaś drzewo nieukorzenione jako ((A, E, B) ((C, F) (D, F))) (Nei i Kumar, 2000).

2.2 CZYNNIKI WPŁYWAJĄCE NA EWOLUCJĘ SEKWENCJI NUKLEOTYDOWYCH

    Pierwszym etapem budowy drzewa jest wykonanie zestawienia analizowanych sekwencji (multiple sequence alignment, MSA), które ma za zadanie przypisanie poszczególnym pozycjom jednej sekwencji odpowiadającym im pozycji w innych sekwencjach. Dopasowanie sekwencji wymaga wstawienia przerw tak, aby otrzymać jak najlepszy wynik. Istnieje cała gama programów wykonujących ten etap analizy jednak najczęściej używanym jest ClustalX i ClustalW.
    Najprostszym współczynnikiem określającym stopień różnicy między dwoma sekwencjami jest stosunek (p) nukleotydów, którymi różnią się dwie sekwencję (nd) do całkowitej liczby nukleotydów (n).
p = nd/n
Współczynnik ten nazywany jest także odległością p między sekwencjami. Odległość p poza prostotą niewiele ma do zaoferowania, ponieważ jest współczynnikiem skrajnie upraszczającym rzeczywistość. Nie uwzględnia on substytucji wstecznych (np. A→C→A) ani innych dostępnych informacji wynikających z charakteru zasad lub aminokwasów. Tą pierwszą wadę da się wyeliminować stosując odległość uwzględniającą rozkład Poissona (odległość PC) lub rozkład gamma. Jeśli chodzi o drugie zastrzeżenie to od dawna wiadomo, że proporcje poszczególnych zasad nie są jednakowe i w zależności od organizmu bądź sekwencji mogą być dalekie od tych które można by oczekiwać z praw statystyki. Zawartość zasad GC może się wahać od 30% do ponad 60%.
    Podobnie substytucje poszczególnych zasad nie są jednakowe. Generalnie można wyróżnić dwa rodzaje substytucji, mianowicie transwersje i tranzycje. Transwersje są podstawieniami jednej puryny (adenina lub guanina) przez drugą purynę lub pirymidyny (tymina, cytozyna) przez inną pirymidynę, a transwersje to zamiana puryny w pirymidynę lub na odwrót (Rys. 6).
Współczynnik tranzycji do tranwersji (R) dla większości genów jądrowych mieści się w przedziale 0.5-2.0, ale dla DNA mitochondrialnego może dochodzić aż do 15. Wynika to z prostej przyczyny, według której tranzycje nukleotydów są bardziej prawdopodobne, ponieważ zamiana zachodzi między związkami o podobnej budowie, natomiast transwersje dotyczą odmiennych strukturalnie związków.  Następnym czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę jest różne tempo ewolucji między poszczególnymi miejscami w obrębie kodonów. Wynika to w prosty sposób z degeneracji kodu genetycznego, który, aby jeszcze bardziej skomplikować sytuację, nie jest w pełni uniwersalny dla wszystkich organizmów. Przyglądając się budowie kodu genetycznego łatwo zauważyć, że pewne zmiany zachodzą łatwiej niż inne, ponieważ nie powodują zmiany odczytu kodu. Zmiany takie nazywamy synonimicznymi i dotyczą praktycznie wszystkich zmian trzeciego nukleotydu kodonów i niektórych zmian zachodzących na pierwszej pozycji. Przykładowo w kodonie CUA kodującym leucynę mutacja A na dowolny nukleotyd, np. U, nie spowoduje żadnej zmiany w odczycie kodonu, CUU nadal koduje leucynę. Podobnie substytucja C→U pozostaje zmianą cichą. Dzięki temu zmiany synonimiczne nie będą wpływać na budowę białka, a więc pozostaną w dużym stopniu neutralne. Zupełnie inaczej przedstawia się sprawa zmian niesynonimicznych czyli takich, które powodują zmianę odczytu kodu. W tym przypadku ich obecność jest widoczna na poziomie białka i może znacząco wpływać na  jego budowę i funkcję. Oczywiście większość tych zmian będzie szkodliwa i dlatego zmiany niesynonimiczne będą szybko eliminowane i jedynie nieliczne zostaną na stałe włączone do genomu i się utrzymają (jest to tzw. selekcja oczyszczająca). Substytucje niesynonimiczne dotyczą zdecydowanej większości zmian pierwszej pozycji kodonów i wszystkich zmian w obrębie drugiej pozycji, które w tym ostatnim przypadku zawsze skutkują zmianami odczytywanego aminokwasu lub mutacjami nonsensownymi. Wracając do naszego przykładu zmiana U w obrębie CUA na inny nukleotyd np. G spowoduje powstanie kodonu kodującego zupełnie inny aminokwas (w tym przypadku argininę).
    Kolejnym ważnym czynnikiem jest dostępność poszczególnych tRNA dla odpowiednich kodonów. To, że dany aminokwas może być kodowany przez np. cztery różne kodony wcale nie oznacza, że tRNA komplementarne do nich będą występować w komórce w takiej samej ilości. Wręcz przeciwnie, w większości przypadków jeden z tRNA występuje obficie, a reszta w znikomych ilościach. W ten sposób kodon dla którego tRNA występuje w dużych ilościach będzie preferowany. Zjawisko to widać szczególnie w odniesieniu do genów podlegających intensywnej ekspresji. Przykładowo częstość kodonów kodujących glicynę w genach polimerazy RNA Escherichia coli wskazuje, że o ile kodony GGU i GGC stanowią zdecydowaną większość to brak całkowicie kodonów GGA i GGG. Współczynnikiem opisującym to zjawisko jest względny poziom użycia kodonów synonimicznych (relative synonymous codon usage, RSCU) odpowiadający stosunkowi obserwowanej częstości występowania kodonu do częstości oczekiwanej przy założeniu jednakowego wykorzystania poszczególnych kodonów (Nei i Kumar, 2000).

2.3 MODELE EWOLUCJI SEKWENCJI NUKLEOTYDOWYCH

Istnieje wiele modeli opisujących sposób zachodzenia substytucji nukleotydowych (Nei i Kumar, 2000). Pierwszym i zarazem najprostszym modelem jest model zaprezentowany w 1969 roku przez Jukesa i Cantora (JC69). Zakłada on, że substytucje zachodzą w każdym miejscu z tą samą częstością i każdy nukleotyd może ulec zmianie na dowolny inny ze stałą częstością α. Jak zaznaczono wcześniej ilość tranzycji jest zwykle większa niż transwersji, co może znacznie wpływać na otrzymany wynik. W związku z tym zaproponowano inny model (K2P) w którym częstość tranzycji określa parametr α, a częstość transwersji parametr β. W modelu K2P częstość wszystkich substytucji wynosi α + 2β. Kolejnym modelem jest jest model zaproponowany przez Felsensteina (F81), który bierze pod uwagę częstość poszczególnych nukleotydów. Modelem dodatkowo uwzględniającym różną zawartość zasad GC jest model Tamury (T92). Inny często używany model HKY jest połączeniem modelu K2P i F81 i uwzględnia zawartość GC i stosunek tranzycji do transwersji. Modelem najbardziej złożonym uwzględniającym 10 oddzielnych parametrów dla każdej możliwej substytucji jest model GTR w którym jedynym przyjmowanym założeniem jest odwracalność ewolucji (Tabela 3). Należy zaznaczyć, że o ile bardziej złożone metody wykorzystujące większą liczbę parametrów z założenia powinny lepiej obrazować odległość między sekwencjami, o tyle wariancja d wzrasta proporcjonalnie do liczby parametrów, tak, że w niektórych przypadkach użycie prostszego modelu może dać taki sam rezultat jak wykorzystanie skomplikowanego modelu wymagającego dużych nakładów mocy obliczeniowej (Nei i Kumar, 2000). Omówione pokrótce powyżej modele substytucji zaliczane są do jednej klasy modeli procesów odwracalnych w czasie (REV), które zakładają możliwość wnioskowania o ewolucji w oparciu o założenie jej odwracalności. Jednak podejście takie niekoniecznie musi być prawdziwe, w związku z czym coraz częściej stosuje się inne bardziej wyrafinowane modele zakładające nieodwracalność procesów substytucji. Mimo, że metody te powstały niedawno dają one obiecujące wyniki i już teraz wykorzystywane są do umiejscowienia korzenia w oparciu o analizowane dane, a nie przez subiektywne wybranie grupy zewnętrznej przez badacza (Yap i Speed, 2005).
spis treści

2.4 CZYNNIKI WPŁYWAJĄCE NA EWOLUCJĘ BIAŁEK

    Także na poziomie białka istnieje szereg czynników wpływających na ich ewolucję, a także na ewolucję DNA kodującego dane białko. Ze względów wspomnianych wcześniej (patrz rozdz. 2.2) wynika, że częstość zmian jednego aminokwasu w inny nie jest czysto losowa. Aminokwasy o właściwościach podobnych będą tutaj wyraźnie preferowane. W praktyce oznacza to, że istnieje większe prawdopodobieństwo, że przykładowo leucyna ulegnie zmianie w izoleucynę niż w argininę. Aspekt ten wynika ze wszystkich właściwości danego aminokwasu takich jak hydrofobowość (regiony hydrofobowe, pogrążone zwykle wewnątrz struktury białka, gdzie oddziałują z innymi aminokwasami niemal z każdej strony, wolniej ewoluują niż aminokwasy hydrofilowe swobodnie wystające do środowiska), kwasowość czy jego wielkość. Ponadto szybkość ewolucji w obrębie domen białka będzie różna i ogólnie jest ona odwrotnie skorelowana ze znaczeniem danego aminokwasu w budowie struktur wyższego rzędu czy centrów aktywnych enzymów. Wykorzystanie tych informacji może korzystnie wpłynąć na poprawność analizy filogenetycznej.
    Podobnie jak w przypadku sekwencji nukleotydowych podobieństwo między dwoma sekwencjami możemy opisać za pomocą liczby oczekiwanych substytucji d, którą dla większej wiarygodności możemy skorygować używając rozkładów gamma i PC. Wartość d dla białek opisuje się także przy pomocy odpowiednio zmodyfikowanych modeli JC69 i K2P, jednak ich użyteczność jako bardzo ogólnych jest wątpliwa, obecnie stosuje się coraz częściej odległość Scoredist, która zakłada poprawkę logarytmiczną obserwowanej wartości d w oparciu o macierz BLOSUM62 (Sonnhammer i Hollich, 2005).

2.5 MODELE EWOLUCJI BIAŁEK

    Ewolucję białek próbuje odtworzyć się poprzez zastosowanie odpowiednich macierzy substytucji o rozmiarze 20 x 20 na podstawie danych empirycznych. Najpierw pojawiły się macierze oparte na modelu akceptowanych mutacji punktowych (PAM) w których jedna jednostka PAM odpowiada różnicy ewolucyjnej między dwoma sekwencjami wynoszącej 1%. Model ten uwzględnia zajście wstecznych substytucji i występowanie pewnych preferencji do częstszych substytucji jednych aminokwasów od innych. W ten sposób możliwe jest wyznaczenie macierzy PAM wyższych rzędów (PAM200-300). Podstawowa macierz o wartości 1 PAM została wyznaczona przez Dayhoff w oparciu o blisko spokrewnione sekwencje, a następnie otrzymane wyniki ekstrapolowano do innych odległości PAM (Tabela 4). Macierze PAM o niskim stopniu są wykorzystywane do analizy blisko spokrewnionych sekwencji, zaś te o większym stopniu do analizy sekwencji odleglejszych ewolucyjnie. Innym powszechnie stosowanym typem macierzy są macierze BLOSUM (Henikoff i Henikoff, 1992) oparte o dane zawarte w bazie danych BLOCKS (Henikoff i Henikoff, 1991). W przeciwieństwie do macierzy PAM macierze BLOSUM powstały w oparciu o sekwencje oddalone ewolucyjnie. Ich liczba oznacza poziom homologi sekwencji, które zostały użyte do stworzenia danej macierzy. Przykładowo, najczęściej używana macierz BLOSUM62 powstała w oparciu o sekwencje wykazujące co najmniej 62% identyczności. Pomiędzy poszczególnymi macierzami BLOSUM nie ma żadnej zależności matematycznej tak jak to miało miejsce w przypadku macierzy PAM. Oprócz tych macierzy powstał cały szereg macierzy wyznaczonych w oparciu o sekwencje białek mitochondrialnych (mtREV24) lub inne bazy danych (JTT, VT, WAG; Whelan i Goldman, 2001). Ponadto dostępne są specjalnie przygotowane macierze pod kątem rybosomalnego RNA (bactSLT, eukSLT, euk23SLT, mitoSLT; Smith i wsp., 2004).
spis treści

2.6 METODY TWORZENIA DRZEW

    Istnieje wiele metod statystycznych wykorzystywanych do konstrukcji drzew. Generalnie metody te można podzielić na kilka grup: metody oparte na odległości (distance methods), metoda parsymonii (największej oszczędności, MP), metoda największej wiarygodności (ML) i metody Bayesa. Oprócz tych metod o potwierdzonej skuteczności próbuje się wykorzystać wiele innych, często z pozytywnym skutkiem. Jedną z najbardziej obiecujących możliwości jest wykorzystanie programowania genetycznego (Lemmon i Milinkovitch, 2002).  Ze względów praktycznych omówione zostaną jedynie wybrane metody, skupając się głownie na ich zaletach i wadach, bardziej szczegółowe dane razem z podstawami matematycznymi można znaleźć w innych źródłach (Nei i Kumar, 2000; Felsenstein 2004).
    Metody oparte na odległości polegają na przedstawieniu różnic między poszczególnymi sekwencjami w postaci liczb, które określają ich wzajemną odległość. Zaletą tej grupy metod jest prostota i szybkość, jednak metody te nie są w stanie zobrazować procesu w sposób idealny, ponieważ nie wszystkie zdarzenia ewolucyjne można odtworzyć na podstawie rozpatrywanych danych. Przykładem takich zmian są wielokrotne substytucje wsteczne. W większości przypadków można to zjawisko w pewien sposób zminimalizować wprowadzając poprawkę proporcjonalną do dywergencji sekwencji. Inną wadą tych metod jest to, że w kolejnych etapach analizy wszelkie obliczenia oparte są na podstawie początkowo wyliczonych wartości, co może oznaczać utratę ważnych informacji. W zależności od implementacji wyróżnia się tu szereg metod takich jak metoda nieważonych średnich połączeń (UPGMA), metoda ostatnich kwadratów (LS), metoda Fitch-Margoliach (FM), metoda minimalnej ewolucji (ME), metoda przyłączania sąsiada (NJ) i jej modyfikacje (BIONJ). Metoda UPGMA polega na łączeniu gałęzi o największym podobieństwie według średnich łączonych par. Podejście takie zakłada istnienie zegara biologicznego i dobrze oddaje relacje między analizowanymi sekwencjami tylko, gdy ich tempo substytucji jest względnie stałe. Warunek ten jest rzadko spełniony i dlatego metoda ta jest rzadko stosowana. Inną metodą jest metoda FM polegająca na zmaksymalizowaniu dopasowania między parami sekwencji przez zminimalizowanie odchylenia kwadratowego obserwowanych odległości w stosunku do wszystkich możliwych długości gałezi drzewa. Wadą tej metody jest brak możliwości oceny uzyskanej topologii drzewa, którą ustala się w oparciu o długość gałęzi drzewa (jednak poszczególne wyniki nie są od siebie w pełni niezależne). Ponadto metoda ta jest tym skuteczniejsza im dłuższych sekwencji użyjemy, co znacznie ogranicza jej wykorzystanie (Nei i Kumar, 2000). Podobne podejście zakłada metoda ME w której sumuje się długości wszystkich gałęzi każdego z możliwych drzew i wybiera się drzewo o najmniejszej ich wartości. Wadą takiego podejścia jest jego czasochłonność przy dużej liczbie sekwencji czego można w pewnym stopniu uniknąć ograniczając liczbę analizowanych topologii, mimo to musimy przeanalizować (N-1)!/2 różnych drzew (jako punkt startowy podaje się drzewo ustalone za pomocą metody NJ; Kumar, 1996). Jedną z najszybszych metod tej grupy jest NJ będąca swego rodzaju uproszczeniem metody ME. Swoją szybkość zawdzięcza temu, że analiza podlega na sprawdzeniu wybranej grupy topologii. Odbywa się to według następującego algorytmu. Drzewem wyjściowym jest drzewo w kształcie gwiazdy, następnie brane są pod uwagę dwa taksony (potencjalni sąsiedzi czyli sekwencje połączone wspólnym węzłem) i porównuje z innymi. Dwa najbardziej podobne taksony (posiadające najkrótszą długość gałęzi) są wybierane, a między nimi wstawiana jest dodatkowa gałąź łącząca je z pozostałymi taksonami drzewa w kształcie gwiazdy. Postępuje się tak, aż do wyczerpania taksonów (Saitou i  Nei, 1987). Wadą tej metody jest to, że uzyskujemy jedno drzewo, które niekoniecznie może być jedynym możliwym rozwiązaniem o ustalonej długości gałęzi.
    Metoda parsymonii czyli oszczędności zakłada, że najlepszym rozwiązaniem jest to najprostsze, czyli takie drzewo, które wymaga najmniej zmian (substytucji). Analizowane są jedynie miejsca w których sekwencje się różnią, pozostałe pozycje są usuwane i nie są dalej wykorzystywane.  Dodatkowo miejsca takie muszą się różnić przynajmniej w dwóch sekwencjach. Założenie to ogranicza w znacznym stopniu zastosowanie tej metody. Z powodu występowania wstecznych substytucji przy wysokim poziomie dywergencji sekwencji metoda ta nie jest w stanie określić prawidłowej topologii drzewa. Ogólnie  metodę tą można stosować, gdy sekwencje mają niski poziom dywergencji (d≤0.1), tempo substytucji jest podobne w obrębie różnych gałęzi i długość sekwencji jest odpowiednio duża. Pewną poprawę może wnieść zastosowanie parsymonii ważonej w której tranzycjom i transwersjom nadawane są inne wagi (Nei i Kumar, 2000). Zaletą i jednocześnie wadą tej metody jest tworzenie wielu optymalnych drzew, czasem ich liczba jest tak duża, że nie pozwala właściwie określić poprawnej topologii (Hedges i wsp., 1991).
    Trzecią grupę metod stanowią metody największego prawdopodobieństwa. Generalnie polegają one na znalezieniu takiego modelu ewolucji, który w najlepszy sposób tłumaczy powstanie określonego drzewa w oparciu o analizowane dane. Najpierw obliczane są cząstkowe wartości wiarygodności dla poszczególnych miejsc, które się następnie wymnaża. Zwykle otrzymana wartość jest bardzo małą niską liczbą i dlatego przedstawia się ją w postaci ujemnego logarytmu. Procedurę obliczania prawdopodobieństw należy powtórzyć dla wszystkich możliwych topologii. Kolejnym pracochłonnym etapem jest obliczenie długości gałęzi. Z tych względów metoda ta jest niezwykle wymagająca pod względem mocy obliczeniowej (Sullivan, 2005). Mimo to metodę największej wiarygodności uważa się obecnie za najskuteczniejszą i jest ona wyraźnie preferowana (Gadagkar i Kumar, 2005; Holder, 2001; Piontkivska, 2004). Niezbędny czas obliczeń można zredukować na dwa sposoby. Pierwszy polega na wyjściu od najbardziej skomplikowanego modelu (o największej liczbie parametrów) i jego stopniowym upraszczaniu aż do momentu, gdy jego dalsze upraszczanie wywoła istotną statystycznie różnicę. W ten sposób w zależności od danych z modelu o 10 parametrach można dojść do innego prostszego modelu co znacznie uprości obliczenia i w efekcie skróci czas analizy (Sullivan, 2005). Innym podejściem może być zastosowanie różnych metod heurystycznych, które wybiorą jedynie nieliczne, najbardziej prawdopodobne topologie i w oparciu o nie wykonają niezbędne obliczenia. Istnieje szereg różnych algorytmów wykonujących to zadanie (dla przykładu patrz Strimmer, 1997) jednak ich omówienie wykracza poza ramy niniejszej pracy. Szczególnie to drugie podejście będzie wykorzystywane przez mnie w praktycznej części pracy.
spis treści

2.7 WIARYGODNOŚĆ OTRZYMANYCH WYNIKÓW

    Standardową procedurą sprawdzającą prawidłowość otrzymanej topologii drzewa jest metoda bootstrap. Polega ona na wygenerowaniu określonej liczby (zwykle 1000) zestawów MSA powstałych z sekwencji użytych do budowy drzewa przez losowy wybór aminokwasów lub nukleotydów z badanej puli z każdorazowym zwracaniem. W ten sposób część pierwotnie występujących aminokwasów/nukleotydów może sigdy niezostać wybrana lub odwrotnie może ulec zwielokrotnieniu. Następnie całą analizę powtarza się odpowiednią liczbę razy na podstawie tak otrzymanych zestawień. Otrzymane wyniki porównywane są z pierwotnym drzewem przez co otrzymujemy procentowe poparcie poprawności danego rozgałęzienia (Nei i Kumar, 2000). Mimo, że metoda ta jest niezwykle użyteczna to jednak powoduje wielokrotne przedłużenie czasu analizy, czasem wręcz uniemożliwiając jej wykonanie. Pewnym rozwiązaniem tego problemu może być użycie innych metod. Jedną z nich jest mapowanie prawdopodobieństwa za pomocą kwartetów, które sprawdza czy dany zbiór sekwencji jest odpowiedni do analizy (Strimmer, 1997). Metoda ta polega na sprawdzaniu stosunków filogenetycznych między losowo wybranymi czterema sekwencjami (kwartetami). Przy odpowiednio licznej próbie na tej podstawie budowane jest uśrednione drzewo końcowe. W przypadku czterech sekwencji istnieją trzy możliwości zbudowania drzewa nieukorzenionego. W zależności od danych drzewo takie może posiadać jednoznaczną (regiony A1, A2, A3), częściowo rozwiązaną (regiony A12, A23, A13), bądź nierozwiązaną strukturę (region A123). Ich procentowy udział pozwala z góry przewidzieć czy analizowane dane są odpowiednie do budowy drzewa. Całość można nanieść na diagram w kształcie trójkąta (Rysunek 12a). Duży udział kwartetów w regionie A123 oznacza, że drzewo wynikowe będzie wykazywać silną politomię.

3. MATERIAŁY I METODY

    Do badań wykorzystano nienadmiarowe sekwencje genów i białek histonowych kręgowców zamieszczone w Histone Sequence Database umieszczone w NHGRI/NCBI (stan na maj 2005 rok, Sullivan i wsp., 2002) z pominienciem nielicznych sekwencji, które były zbyt krótkie. Ponadto przeszukano zasoby GenBank i dołączono szereg sekwencji przewidzianych drogą automatyczną. Do ukorzenienia drzew jako grupy zewnętrznej użyto sekwencji histonowych jeżowców Lytechinus pictus, Parechinus angulosus i Strongylocentrotus purpuratus. W sumie analizą objęto 99 sekwencji białkowych i 83 sekwencji nukleotydowych z 24 gatunków kręgowców i 3 wyżej wymienionych bezkręgowców (Tabela 5 i Tabela 6). Geny histonów poddano obróbce (analizę ograniczono do regionów kodujących białko). Szczegółowe dane na temat numerów dostępu do bazy GenBank wykorzystanych sekwencji i ich długość zamieszczono w Tabeli 6. Dopasowanie sekwencji MSA przeprowadzono za pomocą programu ClustalW i ClustalX przy standardowych ustawieniach (Thompson i wsp., 2003). W przypadku nukleotydów uzyskano MSA o długości 907 nukleotydów (Rysunek 7), a dla białek MSA o długości 308 aminokwasów (Rysunek 8).
   Do budowy drzew metodami dystansu wykorzystano program MEGA3.1 (Kumar i wsp., 2004). Ze względu na złożoność obliczeń, analizy metodą ML przeprowadzono za pomocą programów heurystycznych TREEFINDER (Jobb i wsp., 2004) i TREE-PUZZLE v.5.2 (Strimmer i von Haeseler, 1996), a nie z wykorzystaniem pakietu PHYLIP czy programu PAUP. Wiarygodność uzyskanych wyników sprawdzono przy użyciu metody bootstrap.
  Do analizy sekwencji białkowych matodami ML zastosowano model Dayhoff (PAM) uwzględniając rozkład gamma (dyskretyzacja na 6 przedziałów) dla miejsc zmiennych i miejsc konserwatywnych (niezmiennych) ewolucyjnie (Dayhoff+G+I). Model ten został wybrany na podstawie porównania wartości największego prawdopodobieństwa (-lnL), kryterium informacyjnego Akaike (AIC, AICc) i kryterium informacyjnego Bayesa (BIC) określonych przy pomocy programu Prottest (Abascal i wsp., 2005). Początkowe drzewo ustalono metodą BIONJ (Tabela 7). W wyborze modelu kierowano się głównie wartością AIC, ponieważ jest on bardziej istotny niż wartość -lnL (Posada i Buckley, 2004).Analizę sekwencji nukleotydowych przeprowadzono w oparciu o model HKY+G+I.
spis treści

4. WYNIKI

Tabela 8. Względny poziom użycia kodonów synonimicznych (RSCU) genów histonów łącznikowych.

Tabela 9. Procentowy udział aminokwasów budujących białka histonów łącznikowych.

Rysunek 9. Drzewo filogenetyczne białek histonowych H1 i H5 skonstruowane metodą najbliższego sąsiada NJ w oparciu o nieskorygowaną odległość p.

Rysunek 10. Drzewo filogenetyczne białek histonów łącznikowych skonstruowane metodą największego prawdopodobieństwa ML w oparciu o macierz Dayhoff z uwzględnieniem rozkładu gamma dla miejsc zmiennych (6 przedziałów) i miejsc niezmiennych.Drzewo zbudowano za pomocą programu TREE-PUZZLE. 

Rysunek 11. Drzewo filogenetyczne ML białek histonowych H1 i H5 w oparciu o macierz Dayhoff z uwzględnieniem rozkładu gamma dla miejsc zmiennych (dyskretyzacja na 6 przedziałów) i miejsc niezmiennych.  Drzewo zbudowano za pomocą programu Treefinder.

Rysunek 12. Mapowanie prawdopodobieństwa za pomocą trójkątów prawdopodobieństwa wykonane za pomocą programu TREE-PUZZLE. 

Rysunek 13. Drzewo filogenetyczne nukleotydowych sekwencji kodujących histony H1 i H5 skonstruowane metodą najbliższego sąsiada NJ na podstawie liczby synonimicznych różnic między sekwencjami obliczonymi zmodyfikowaną metodą Nei-Gojobori (na podstawie odległości p oraz współczynnika R = 0.76).

Rysunek 14. Drzewo filogenetyczne ML nukleotydowych sekwencji kodujących histony H1 i H5 skonstruowane metodą kwartetów według modelu HKY z rozkładem gamma dla miejsc zmiennych (6 przedziałów) i miejsc niezmiennych.  Drzewo zbudowano za pomocą programu TREE-PUZZLE.

Rysunek 15. Drzewo filogenetyczne ML sekwencji nukleotydowych kodujących histony łącznikowe w oparciu o model HKY z rozkładem gamma dla miejsc zmiennych (6 przedziałów) i miejsc niezmiennych.  Drzewo zbudowano za pomocą programu Treefinder. 
spis treści

5. OMÓWIENIE WYNIKÓW

5.1 BIAŁKA HISTONOWE

      Histony łącznikowe to podrodzina białkowa w obrębie histonów, która cechuje się najszybszym tempem ewolucji pozostając jednocześnie dość konserwatywną grupą białek. Histony H1 i H5 są małymi białkami o długości około 200 aminokwasów. Cechuje je wybitna zasadowość. Stosunek aminokwasów zasadowych do kwaśnych wynosi 7:1. Ponadto występuje tu prawie trzy razy więcej aminokwasów niepolarnych (Tabela 9). Histony łącznikowe zbudowane są z trzech domen z których najbardziej konserwatywna jest domena centralna, która wykazuje silne podobieństwo nawet u odległych ewolucyjnie organizmów. Widoczne to jest w zestawieniu białek histonowych, które w tym regionie posiada mało przerw oraz duże ogólne podobieństwo budujących je aminokwasów (Rysunek 7).
    Ze względu na dużą liczbę krótkich sekwencji drzewo obrazujące stosunki filogenetyczne białek histonowych zostało wykonane w oparciu o niepoprawioną wartość p metodą NJ (Rysunek 9), ponieważ wartość ta ma małą wariancję i doświadczalnie wykazano, że w takich sytuacjach daje ona względnie dobre wyniki niejednokrotnie wyprzedzając inne bardziej skomplikowane metody (Nei i Kumar, 2000). Różnice odległości p pomiędzy poszczególnymi sekewencjami białkowymi wahały się w szerokim zakresie średnio wynosząc 0.44 ± 0.04.  Dodatkowo skonstruowano drzewa w oparciu o metodę ML (Rysunek 10 i Rysunek 11) oraz przeprowadzono mapowanie prawdopodobieństwa (Rysunek 12b). Otrzymane drzewa  nieznacznie się różnią, jednak każde z nich wykazuje charakterystyczną cechę polegającą na tym, że poszczególne białka grupują się w zależności od podtypu, a nie ze względu na pochodzenie. Dopiero w obrębie poszczególnych grup można zauważyć typowe rozgałęzienia obrazujące relacje międzygatunkowe. Jedynym wyjątkiem od tej zasady są histony łącznikowe kury, które wyraźnie tworzą odrębną grupę. Na dzień dzisiejszy trudno wynioskować czemu się tak dzieje, niezbędna będzie większa liczba danych pochodzących od innych ptaków.
spis treści

5.2 SEKWENCJE NUKLEOTYDOWE

   Analizę sekwencji nukleotydowych ograniczono do regionów kodujących białka. Wynika to z fragmentaryczności danych, w wielu przypadkach brak jest pełnych odcinków promotorowych. Zbadano stosunek poszczególnych zasad, który przedstawia się: T – 0.11755, C – 0.28604, G – 0.28838, A – 0.30802. Dodatkowo obliczono względny poziom użycia kodonów synonimicznych RSCU (Tabela 8). Współczynnik tranzycji/transwersji R wynosi 0.76 ± 0.03 (odpowiednio 0.77 ± 0.04, 0.93 ± 0.07, 0.66 ± 0.03 dla pierwszej, drugiej i trzeciej pozycji kodonów). Zbadano różnicę synonimiczne (pS) i niesynonimiczne (pN) między poszczególnymi sekwencjami. W cele zbadania jaki rodzaj selekcji kieruje ewolucją histonów łącznikowych przeprowadzono test statystyczny Z oparty na kodonach. Jako hipotezę  zerową H0 przyjęto pS = pN (selekcja neutralna), a hipotezami alternatywnymi H1 i H2 były pS > pN (selekcja oczyszczająca)  i pS < pN (selekcja pozytywna). Hipoteza zerowa została odrzucona z prawdopodobieństwem błedu P < 0.05. Prawdziwą okazała się być jedynie hipoteza H1. 
   Podobnie jak w przypadku sekwencji białkowych skonstruowano trzy drzewa filogenetyczne według podobieństwa sekwencji nukleotydowych. Pierwsze oparte na względnie prostych metodach dystansu między sekwencjami (Rysunek 13) i dwa pozostałe zbudowane według metod ML (Rysunek 14 i Rysunek 15). Dodatkowo przeprowadzono mapowanie prawdopodobieństwa za pomocą programu TREE-PUZZLE (Rysunek 12c).

6. DYSKUSJA

   Białka histonowe są rodziną silnie konserwatywnych białek wsród których wyróżnia się pięć podrodzin. Jedną z nich są histony łącznikowe H1 i H5. Jest to heterogenna grupa złożona z kilku białek, których liczba zależy od organizmu i może wynosić do 9 w zależności od gatunku. Fakt, że występują one w wielu niealllelicznych kopiach potwierdzają badania organizmów pochodzących z różnych królestw według których histony łącznikowe są obecne zawsze przynajmniej w dwóch formach u wszystkich zanalizowanych pod tym kątem organizmów (ponad 100 gatunków grzybów, roślin i zwierząt; Kasinsky i wsp., 2001).
   Celem niniejszych badań nie jest ustalenie kiedy poszczególne formy histonów łącznikowych powstały, ponieważ według badań Ponte i współpracowników somatyczne histony łącznikowe i histon H1t rozdzieliły się 406 ± 80 milionów lat temu czyli wcześniej niż wykształciły się ssaki, a nawet kręgowce (Ponte i wsp., 1998). Podstawowym zadaniem pracy jest zbadanie jak kształtował się proces ewolucji histonów łącznikowych i jaki rodzaj selekcji był główną siłą kształtującą relacje w tej rodzinie. Poznanie tych procesów pod kątem molekularnym pozwoli rozstrzygnąć jak będzie się kształtować ten proces w dalszej przyszłości.
   Ewolucję wielogenowych rodzin starano się wytłumaczyć za pomocą kilku modeli ewolucyjnych. Pierwszym takim modelem był model ewolucji różnicującej (divergent evolution) według którego poszczególne geny powstały z macierzystego genu w wyniku procesu duplikacji i stopniowego nagromadzania się różnic między powstałymi genami. Model ten doskonale tłumaczył proces ewolucji białek rodziny globulinowej jednak w miarę napływu nowych danych okazał się nieadekwatny do innych rodzin białkowych w których zaobserwowano, że często mamy doczynienia z wieloma tandemowo powtórzonymi genami, które są niemal identyczne u danego organizmu i różne u organizmów pokrewnych. Taka sytuacja kształtuje się na przykład w obrębie rodziny rybosomalnych RNA (rRNA). W związku z tym zaproponowano nowy model nazwany ewolucją jednorodną (concerted evolution). Zakłada on, że wszystkie geny rodziny ewoluują w sposób jednorodny jako jedna niepodzielna całość czyli poszczególne geny rodziny przestają być niezależne. Wszelkie zachodzące mutacje rozprzestrzeniają się na sąsiednich przedstawicieli rodziny za pomocą wielokrotnego crossing over lub w wyniku konwersji genów. Aż do początku lat 90-tych większość badaczy przyjmowała, że właśnie tak kształtują się procesy ewolucji rodzin genowych. Wszelkie sprzeczności, które pojawiały się wraz z nagromadzeniem coraz większej ilości danych molekularnych próbowno wyjaśnić odpowiednio modyfikując model. Jednak zastosowanie ewolucji jednorodnej nie było możliwe w przypadku olbrzymiej różnorodności z jaką się zetknięto w przypadku białek układu odporności a mianowicie przeciwciał i białek MHC. W związku z powyższym zaproponowano inny, obowiązujący do dziś, model ewolucji narodzin i śmierci (birth-and-death evolution). Zakłada on powstanie nowych genów w wyniku duplikacji w efekcie których nowe geny mogą zostać włączone na stałe lub też mogą być usunięte lub przekształcone w pseudogeny (Nei i Hughes, 1992; Nei i Rooney, 2005). To właśnie obecność pseudogenów była przyczyną głównych kontrowersji i źródłem krytyki modelu ewolucji jednorodnej. Istnieje możliwość rozróżnienia, który model ewolucji lepiej pasuje do analizowanych danych. Jednym podejściem może być zbadanie jaki rodzaj selekcji dominuje. Jeśli będziemy mieli doczynienia z selekcją oczyszczającą najprawdopodobniejszym modelem będzie model birth-and-death. Z drugiej strony należy przyjrzeć się relacjom jakie panują między poszczególnymi członkami rodziny.
  Podstawowym założeniem selekcji oczyszczającej jest to, że liczba różnic synonimicznych (pS) przewyższa liczbę różnic niesynonimicznych (pN). Tak też kształtuje się sytuacja w przypadku histonów łącznikowych. Przeprowadzony test Z oparty na kodonach jednoznacznie wykluczył pozostałe dwie możliwości. Niemniej jednak w przypadku niewielkich różnic między analizowanymi genami test ten może okazać się zbyt liberalny. W istocie porównanie między kilkoma genami pewnych subtypów histonów łącznikowych występujących u jednego organizmu (np. H1t u Homo sapiens) nie pozwala rozstrzygnąć tego problemu. W takich przypadkach o ewolucji pewnych białek nie da się wnioskować w ten sposób. Problem ten można rozwiązać inaczej. Należy podejść do sprawy od drugiej strony i sprawdzić jakie są konsekwencje ewolucji zgodnie z założeniami poszczególnych modeli, a następnie porównać je z otrzymanymi wynikami. Właśnie takie podejście zostało wykorzystane w niniejszej pracy. Jeśli przyjmiemy, że rodzina genowa ewoluuje zgodnie z modelem jednorodnym powinniśmy oczekiwać, że poszczególni członkowie rodziny będą bardzo podobni w obrębie gatunku, a różni między gatunkami. Efektem tego będzie skupienie się genów danego gatunku w jedną grupę na drzewie filogenetycznym. Inaczej będzie wyglądać sytuacja w przypadku ewolucji birth-and-death. Tutaj geny będą się skupiać w grupy pod względem przynależności do danego subtypu a nie gatunku.
    Analizę histonów łącznikowych przeprowadzono na poziomie nukleotydów i białka. Otrzymane wyniki są bardzo podobne i bez względu na zastosowaną metodę konstrukcji drzew wykazują wyrażne podobieństwa. Na początku skonstruowano drzewa w oparciu o metody dystansu (Rysunek 9 i Rysunek 13) stosując algorytm NJ. W pierwszym przypadku podstawą drzewa była nieskorygowana odległość p, ponieważ białka histonowe są krótkie, a liczba analizowanych sekwencji była dość duża. W takim przypadku uzasadnione wydaje się zastosowanie nawet tak uproszczonego modelu ewolucji. Dla zobrazowania procesów ewolucji sekwencji nukleotydowych zastosowano zmodyfikowaną metodę Nei-Gojobori, która rozróżnia substytucje synonimiczne od niesynonimicznych oraz pozwala uwzględnić różną częstość zachodzenia tranzycji i transwersji (współczynnik R). Metodę tą wybrano, ponieważ wartość R = 0.76 różniła się od wartości oczekiwanej w przypadku jednakowego tempa tranzycji i transwersji (R = 0.5). Metody te mają dodatkową zaletę jaką jest mała liczba parametrów co pozwala na szybkie otrzymanie rezultatów (czas konstruowania tych drzew nie przekraczał 10 minut na komputerze Celeron 2.6GHz).
  Następnym etapem badań było skonstruowanie drzew w oparciu o zasady największego prawdopodobieństwa. W przypadku białek zastosowano macierz Dayhoff (Tabela 4). Ponadto za pomocą rozkładu gamma uwzględniono możliwość nierównomiernego tempa substytucji w zależności od znaczenia danego miejsca dla funkcjonowania genu. Wprowadzono także dodatkowy parametr dla miejsc konserwatywnych ewolucyjnie (Rysunek 10 i Rysunek 11). Analizę sekwencji nukleotydowych oparto o model HKY (Tabela 3), który bierze pod uwagę współczynnik R oraz różną proporcję poszczególnych zasad (Rysunek 14 i Rysunek 15). Otrzymane topologie różniły się nieznacznie nawet w przypadku zastosowania metod zaliczanych do tej samej grupy (ML). Wynikać to może z kilku czynników. Otóż w przypadku metod ML zastosowano dwa odmienne programy znacznie różniące się podejściem do problemu. Program TREE-PUZZLE opiera się na dość szczególnej metodzie kwartetów. Pozwala ona wnioskować o stosunkach filogenetycznych na podstawie kwartetów (czwórek) sekwencji i tak otrzymane wyniki ekstrapoluje się tworząc drzewo końcowe. Dodatkową zaletą programu jest to, że przed rozpoczęciem głównej analizy można sprawdzić za pomocą mapowania prawdopodobieństwa czy dane są odpowiednio dobrane. W przypadku sekwencji histonów łącznikowych wyniki te były wystarczająco dobre (ponad 80% kwartetów faworyzuje ściśle określoną topologię). Jednak blisko w 10% przypadków metoda kwartetów okazała się być niejednoznaczna. Procent ten był identyczny w przypadku sekwencji białkowych i nukleotydowych co jest dość dziwne, ponieważ z założenia im dłuższe sekwencje tym lepiej powinna sprawować się metoda kwartetów. Jedynym wytłumaczeniem może być to, że w obrębie analizowanej grupy sekwencji część z nich różniła się wyraźnie od pozostałych wprowadzając zakłócenia. Najwyższy procent nierozstrzygniętych kwartetów posiadały krótkie sekwencje białkowe (na przykład histon H1 pochodzący z Anguilla japonica) oraz długie histony podtypu H1M/B4. Mimo to nie zostały one usunięte. Prawdopodobnie to jest przyczyną powstania licznych węzłów wyższego rzędu. Niemniej jednak drzewa otrzymane za pomocą tego programu nadal wyglądają dobrze. Dodatkowo zbudowano drzewa ML za pomocą programu Treefinder, ponieważ symulacje potwierdziły jego wyższość nad programem TREE-PUZZLE. Program ten skutecznością dorównuje programom z pakietu PHYLIP będąc wiele razy szybszym. Dlatego za najbliższe rzeczywistości uznaję właśnie drzewa skonstruowane za pomocą programu Treefinder. Dodatkowo w tym przypadku test bootstrap daje wysokie poparcie dla większości otrzymanych gałęzi.
   Bez względu na metodę konstrukcji drzew oraz model ewolucji, który przyjęto wyniki okazały się być wyjątkowo spójne. Histony łącznikowe grupują się w zależności od podtypu danego białka/genu. Dopiero w obrębie grupy można zaobserwować typowe relacje międzygatunkowe jakich można by oczekiwać pod kątem pokrewieństwa. Rozdział na grupy jest silnie poparty testem bootstrap i jest obecny w każdym z drzew. Jedynym wyjątkiem od tej zasady są histony łącznikowe ptaków i płazów, które wyraźnie tworzą oddzielne grupy skupiające wszystkie podtypy z wyjątkiem histonu H1° i H5. Sekwencje tych organizmów są silnie konserwatywne. Niestety nie sposób wnioskować czemu tak jest, ponieważ brak jest jakichkolwiek sekwencji histonów łącznikowych pochodzących od gadów. Jest to tym większe utrudnienie, gdyż według danych paleontologicznych to właśnie gady są grupą od której wywodzą się zarówno ptaki jak i ssaki (Krzanowska i wsp., 2002). Tak, więc u gadów musiał nastąpić jakiś bliżej nieokreślony proces ewolucyjny, który z jednej strony faworyzował u przodków ptaków dalszy proces homogenizacji histonów łącznikowych, którego początki można zaobserwować u płazów, zaś z drugiej strony histony łącznikowe gadów będących protoplastami ssaków zaczeły się silnie różnicować w wyniku czego wykształcił się silny podział na grupy w zależności od podtypu białka, a nie gatunku, co jest widoczne na drzewach filogenetycznych. Przyczyny i przebieg tego zjawiska nie są znane i jego wyjaśnienie będzie wymagać szczegółowej analizy histonów łącznikowych pochodzących od gadów.
  Jako pierwsza wyodrębnia się grupa histonów H1M/B4, następnie powstają histony niezależne od procesu replikacji H1° i H5 oraz histony H1X. Kolejną grupą są somatyczne histony łącznikowe wraz z histonami H1t. W obrębie tej grupy jako pierwsze oddzielają się histony H1t. Spośród histonów somatycznych najlepiej wyróżniającą się grupą jest podtyp H1.1. Pomimo tych podobieństw trafiają się istotne różnice między poszczególnymi drzewami. Analizą objęto także szereg sekwencji otrzymanych metodami automatycznymi oraz nie opisanych jako histony łącznikowe, ale mimo to umieszczonymi w Histone Database. Większość z nich ustawicznie lokuje się w tym samym miejscu względem innych sekwencji co pozwala jednoznacznie zaliczyć je do określonego podtypu (na przykład histon H1° pochodzący od Bos taurus i Canis familis w przypadku sekwencji przewidzianych metodami automatycznymi oraz białko Tetraodon nigroviridis oznaczone jako CAG04363). Czasem sekwencje takie okazały się jedynie zbliżonymi do histonów łącznikowych o czym może świadczyć nienormalnie wydłużona gałąź tak jak to ma miejsce w przypadku białka Tetraodon nigroviridis (CAF90042), które prawdopodobnie histonem łącznikowym nie jest.
   Otrzymane wyniki jednoznacznie wskazują, że rodzina histonów łącznikowych ewoluuje zgodnie z modelem birth-and-death z silną selekcją oczyszczającą. Podobny wniosek otrzymali także inni autorzy (Eirin-Lopez i wsp., 2004; Eirin-Lopez i wsp., 2005), jednak ich badania opierały się głównie na porównaniu proporcji substytucji synonimicznych (pS) i niesynonimicznych (pN), a zastosowane metody konstrukcji drzew były ograniczone jedynie do metod dystansu. W niniejszej pracy potwierdzono te wyniki stosując wiele innych metod, które na dzień dzisiejszy uznaje się za najodpowiedniejsze i najbardziej miarodajne. Należy podkreślić, że również ewolucja histonów rdzeniowych kształtowana jest zgodnie z modelem birth-and-death (Piontkivska i wsp., 2002; Rooney i wsp., 2002).
spis treści

WAŻNIEJSZE ADRESY INTERNETOWE

GenBank     http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank
Protein Data Bank     http://www.rcsb.org
Histone Sequence Database http://research.nhgri.nih.gov/histones/
Treeview  http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/treeview.html
RasMol   http://www.umass.edu/microbio/rasmol/index2.htm
Treefinder   http://www.treefinder.de/
ClustalX   ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/ClustalX/
ClustalW   ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/ClustalW/
TREE-PUZZLE  http://www.tree-puzzle.de/
PHYLIP http://evolution.genetics.washington.edu/phylip.htm
MEGA 3.1 http://www.megasoftware.net/
Prottest   http://darwin.uvigo.es/software/prottest.html
spis treści

LITERATURA

Abascal, F., Zardoya, R., Posada, D. (2005) ProtTest: Selection of best-fit models of protein evolution. Bioinformatics: 21(9), 2104-2105.
Alami, R., Fan, Y., Pack, S., Sonbuchner, T.M., Besse, A., Lin, Q., Graelly, J.M., Skoultchi, A.I., Bouhassira, E.E. (2003) Mammalian linker-histone sybtypes differentially affect gene expression in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. 100(10), 5920-5925.
Baxevanis, A.D. I Ouellette, B.F.F. (2004) Bioinformatyka. Podręcznik do analizy genów i białek. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa.
Bednar, J., Horowitz, R.A., Grigoriev, S.A., Carruthers, L.M., Hansen, J.C.,Koster, A.J., Woodcock, C. L. (1998). Nucleosomes, linker DNA, and linker histone form a unique structural motif that directs the higher-order folding and compaction of chromatin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 14173-14178.
Bernstein, H.J. (2000) Recent changes to RasMol, recombining the variants. Trends Biochem. Sci. 25, 453-455.
Chakravarthy, S., Park, Y.J., Chodaparambil, J., Edayathumangalam, R.S., Luger, K. (2005) Structure and dynamic properties of nucleosome core particles. FEBS Lett. 579, 895-898.
Clarke, H.J., Oblin, C., Bustin, M. (1992) Developmental regulation of chromatin composition during mouse embryogenesis: somatic histone H1 is first detectable at the 4-cell stage. Development 115, 791-799.
Clarke, H.J., Bustin, M., Oblin, C. (1997) Chromatin modyfications during oogenesis in the mouse; removal of somatic subtypes of histone H1 from oocyte chromatin occurs post-natally throug a post-transcriptional mechanism. J. Cell Sci. 110, 477-487.
Cotton, J.A. (2003) Vertebrate phylogenomics and gene family evolution. PhD thesis. University of Glasgow. Scotland.
Dominsky, Z., Marzluff, W.F. (1999) Formation of the 3`end of histone mRNA. Gene 239, 1-14.
Dong, Y., Liu, D., Skoultchi, A.I. (1995) An upstream control region required for inducible transcription of the mouse H1º histone gene during terminal differentiation. Mol. Cell. Biol. 15(4), 1889-1990.
Eirin-Lopez, J.M., Gonzalez-Tizon, A.M., Martinez, A., Mendez, J. (2004) Birth-and-Death Evolution with Strong Purifying Selection in the Histone H1 Multigene Family and the Origin of orphon H1 Genes. Mol Biol Evol 21(10), 1992-2003.
Eirin-Lopez, J.M., Ruiz, M.F., Gonzalez-Tizon, A.M., Martinez, A., Ausio, J., Sanchez, L., Mendez, J. (2005) Common evolutionary origin and birth-and-death process in the replication-independent histone H1 isoforms from vertebrate and invertebrate genomes. J Mol Evol 61, 398-407.
Fan, Y., Nikitina, T., Morin-Kensicki, E.M., Zhao, J., Magnuson, T.R., Woodcock, Ch.L., Skoultchi, A.I. (2003) H1 linker histones are essential for mouse development and affect nucleosome spacing in vivo. Mol. Cell. Biol. 23(13), 4559-4572.
Fan, Y., Sirotkin, A., Russell, R.G., Ayala, J., Skoultchi, A.I. (2001) Individual somatic H1 subtypes are dispensable for mouse development even in mice lacking the H1º replacement subtype. Mol. Cell. Biol. 21(23), 7933-7943.
Fan, Y., Skoultchi, A.I. (2003) Genetic analisis of H1 linker histone subtypes and their functions in mice. Methods Enzymol., 377, 85-107.
Fantz, D.A., Hatfield, W.R., Horvath, G., Kistler, M.K., Kistler W.S. (2001) Mice with targeted disruption of the H1t gene are fertile and undergo normal changes in structural chromosomal proteins during spermatogenesis. Biol. Reprod. 64, 425-431.
Felsenstein, J. (2004) Inferring Phylogenies. Sinauer Associates.
Franke, K., Drabent, B., Doenecke, D. (1998) Expression of murine H1 histone genes during postnatal development. Biochim. Biophys. Acta 1398, 232-242.
Gadagkar, S.R., Kumar, S. (2005) Maximum Likelihood Outperforms Maximum Parsimony Even When Evolutionary Rates Are Heterotachous. Mol. Biol. Evol. 22(11), 2139-2141
Gajiwala, K.S., Burley, S.K. (2000) Winged helix proteins. Curr. Opin. Struct. Biol. 10, 110-116.
Górnicka-Michalska, E., Pałyga, J., Kowalski, A., Cywa-Benko, K. (2006) Sequence variants of chicken linker histone H1.a. FEBS J. 273, 1240-1250.
Grimes, S.R., Wilkerson, D.C., Noss, K.R., Wolfe, S.A. (2003) Transcriptional control of the testis-specyfic histone H1t gene. Gene 304, 13-21.
Hedges, S.B., Kumar, S., Tamura, K. (1992) Human orgins and analysis of mitochondrial DNA sequences. Science 255, 737-739.
Hendzel, M.J., Level, M.A., Crawford, E., Th`ng, J.P.H. (2004) The Cterminal domain is the primary determinant of histone H1 binding to chromatin in vivo. J. Biol. Chem. 279(19), 20028-34.
Henikoff, S. i Henikoff J.G. (1991) Automated assembly of protein blocks for database searching. Nucleic Acids Res. 19, 6565-6572.
Henikoff, S. i Henikoff J.G. (1992) Amino acid substitution matrices from protein blocks. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10915-10919.
Holder, M. T. (2001) Using a Complex Model of Sequence Evolution to Evaluate and Improve Phylogenetic Methods. PhD thesis. The University of Texas at Austin, USA.
Jenuwein, T., Allis, D.C. (2001) Translating the histone code. Science 293(5532), 1074-1080.
Jobb, G., von Haeseler, A., Stimmer, K. (2004) TREEFINDER: a powerful graphical analysis environment for molecular phylogenetics. BMC Evolutionary Biology 4, 18-26.
Kasinsky, H.E., Lewis, J.D., Dacks, J.B., Ausio, J. (2001) Origin of H1 linker histones. The FASEB Journal 15, 34-42.
Khochbin, S. (2001) Histone H1 diversity: binding regulatory signals to linker histone function. Gene 271, 1-12.
Khochbin, S. i Wolffe, A.P. (1994) Developmentally regulated exspressin of linker-histone variants in vertebrates. Eur. J. Biochem. 225, 501-510.
Khorasanizadeh, S. (2004) The nucleosome from genomic organization to genomic regulation. Cell 116, 259–272.
Kłyszejko – Stefanowicz, L. (2002). Cytobiochemia. Biochemia niektórych struktur komórkowych. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa.
Koutzamani, E., Loborg, H., Sarg, B., Lindner, H.H., Rundquist, I. (2002) Linker histone subtype composition and affinity for chromatin in situ in nucleated mature eryhrocytes. J. Biol. Chem. 277(47), 44688-44694.
Kowalski, A., Pałyga, J., Górnicka-Michalska, E. (2004) Identification of histone H1.z components in a Muscovy duck (Cairina moschata L.) population. Comp. Biochem. Physiol. B 137, 151-157.
Kozłowski, Ł. (2004) Zróżnicowanie histonu H1 u kręgowców. Akademia Świętokrzyska. Praca licencjacka.
Krzanowska, H., Łomnicki, A., Rafiński, J., Szarski, H., Szymura, J.M. (2002) Zarys mechanizmów ewolucji. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa.
Kumar, S. (1996) A Stepwise Algorithm for Finding Minimum Evolution Trees. Mol. Biol. Evol. 13(4), 584-593.
Kumar, S., Tamura, K., Nei, M. (2004) MEGA3: Integrated software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and sequence alignment. Brief. Bioinform. 5, 150-163
Lemmon, A.R., Milinkovitch, M.C. (2002) The metapopulation genetic algorithm: an efficient solution for the problem of large phylogeny estimation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 10516-10521.
Lennox, R.W. i Cohen, L.H. (1983) The histone H1 complements of dividing and nondividing cells of the mouse. J. Biol. Chem. 258(1), 262-268.
Lin, Q., Sirotkin, A., Skoultchi, A.I. (2000) Normal spermatogenesis in mice lacking the testis-specyfic linker histone H1t. Mol. Cell. Biol. 20(6), 2122-2128.
Luger, K., Hansen, J.C. (2005) Nucleosome and chromatin fiber dynamics. Curr. Opin. Struct. Biol. 15, 188-196.
Nei, M., Hughes, A.L. (1992) Balanced polymorphism and evolution by the birth-and-death process in the MHC loci. In 11th Histocompatibility Workshop and Conference, ed. Tsuji, K., Aizawa, M., Sasazuki, T. pp. 27–38. Oxford, UK: Oxford Univ. Press.
Nei, M., Kumar, S. (2000) Molecular evolution and phylogenomics. Oxford University Press.
Nei, M., Rooney, A.P. (2005) Concerted and birth-and-death evolution of multigene families. Annu. Rev. Genet. 39, 121-152.
Pałyga, J. (1990) Variability of histone H1 in rabbit populations. Int. J. Biochem. 22, 1351-1361.
Pałyga, J., Górnicka-Michalska, E., Kowalski, A., Książkiewicz, J. (2000) Natural allelic variation of duck eryhrocyte histone H1b. Int. J. Biochem. Cell Biol. 32, 665-675.
Piontkivska, H. (2004) Efficiencies of maximum likelihood methods of phylogenetic interferences when different substitutions model are used. Mol. Phylogent. Evol. 31, 865-873.
Piontkivska, H., Rooney, A.P., Nei, M. (2002) Purifying Selection and Birth-and-death Evolution in the Histone H4 Gene Family. Mol Biol Evol 19, 689-697.
Ponte, I., Vidal-Taboada, J.M., Suau, P. (1998) Evolution of the vertebrate H1 histone class: evidence for the functional differentation of the subtypes. Mol. Biol. Evol. 15(6), 702-708.
Ponte, I., Vila, R., Suau, P. (2003) Sequence Complexity of Histone H1 Subtypes. Mol. Biol.  Evol. Vol.20, No.3, 371-380.
Posada, D., Buckley, T.R. (2004) Model selection and model averaging in phylogenetics: advantages of Akaike Information Criterion and Bayesian approaches over likelihood ratio tests. Syst. Biol. 53(5), 793-808.
Ramakrishnan, V. (1997) Histone structure and the organization of the nucleosome. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 83-112.
Rooney, A.P., Piontkivska, H., Nei, M. (2002) Molecular evolution of the nontandemly repeated genes of the histone 3 multigene family. Mol. Biol. Evol. 19(1), 68-75.
Saitou, N. i  Nei, M. (1987) The Neighbor-joining Method: A New Method forReconstructing Phylogenetic Trees. Mol. Biol. Evol. 4(4), 406–425.
Sirotkin, A.M., Edelmann, W., Cheng, G., Klein- Szanto, A., Kucherlapati, Skoultchi, A.I. (1995) Mice develop normally without the H1º linker histone. Proc. Natl. Acad. Sci. 92, 6434-6438.
Smith, A.D., Lui T.W.H., Tillier E.R.M. (2004) Empirical models for substitution in ribosomal RNA. Mol. Biol. Evol. 21(3), 419–427.
Sonnhammer, E.L.L., Hollich, V. (2005) Scoredist: A simple and robust protein sequence distance estimator. BMC Bioinformatics 6, 108-11.
Strimmer, K., von Haeseler, A. (1996) Quartet-puzzling: A quartet maximum-likelihood method for reconstructing tree topologies. Mol. Biol. Evol. 13, 964–969.
Strimmer, K.S. (1997) Maximum likelihood methods on molecular phylogenetics. PhD thesis. University of Munich. Germany.
Sullivan, J. (2005) Maximum likelihood methods for phylogeny estimation. Method. Enzymol. 395, 757-779.
Sullivan, S., Sink, D.W., Trout, K.L., Makalowska, I., Baxevanis, A.D., Landsman, D. (2002) The Histone Database. Nucleic Acids Res. 30(1), 341-342.
Takami, Y., Nakayama, T. (1997) A single copy of linker H1 genes is enogh for proliferation of the DT40 chicken B cell line, and linker H1 variants participate in regulation of gene expression. Genes Cells 2, 711-723.
Takami, Y., Nishi, R., Nakayama, T. (2000) Histone H1 variants play individual roles on transcription regulation in the DT40 chicken B cell line. Biochem. Biophys. Res. Commun. 268, 501-508.
Tanaka, M., Hennebold, J.D., Macfarlane, J., Adashi, E.Y. (2001) A mammalian oocyte-specific linker histone gene H1oo: homology with the genes for the oocyte-specific cleavage stage histone ( cs-H1) of sea urchin and the B4/H1M histone of the frog. Development 128, 655-664.
Thompson, J.D., Gibson, T.J., Higgins, D.G. (2003) Multiple sequence alignment using ClustalW and ClustalX. Curr. Prot. Bioinf. 2.3.1-2.3.22
Travers, A. (1999) The location of the linker histone on the nucleosome. Trends Biochem. Sci. 24, 4-7.
Turner, B.M. (2002) Cellular memory and histone code. Cell 111, 285–291.
Vila, R., Ponte, I., Collado, M., Arrondo, J.L.R., Jiménez, M.A., Rico, M., Suau, P. (2001) DNA-induced α-Helical Structure in the NH2-terminal Domain of Histone H1. J. Biol. Chem. 276(49), 46429-46435.
Vila, R., Ponte, I., Jiménez, M.A., Rico, M., Suau, P. (2000) A helix-turn motif in the C-terminal domain of histone H1. Protein Sci. 9, 627-636.
Vila, R., Ponte, I., Jiménez, M.A., Rico, M., Suau, P. (2002) An inducible helix–Gly–Gly–helix motif in the N-terminal domain of histone H1e. A CD and NMR study. Protein Sci. 11, 214-220.
Wang, Z.-F., Sirotkin, A.M., Buchold, G.M., Skoultchi, A.I., Marzluff, W.F., (1997) The mouse histone H1 genes: gene organization and differential regulation. J. Mol. Biol. 271, 124-138.
Whelan, S., Goldman, N. (2001) A general empirical model of protein evolution derived from multiple protein families using a maximum likelihood approach. Mol. Biol. Evol. 18, 691-699.
Wierzbicki, A.T. (2002) Zagadka histonu H1. Post. Biochem. 43 (3), 167-174.
Wierzbicki, A.T., Jerzmanowski, A. (2004) Suppression of histone H1 genes in Arabidopsis results in heritable developmental defects and stochastic changes in DNA methylation. Genetics 104.031997v1.
Wilkerson, D.C., Wolfe, S.A., Grimes, S.R. (2002) H1t/GC-box and H1t/TE1element are essential for promoter activity of the testis-specyfic histone H1t gene. Biol. Reprod. 67, 1157-1164.
Yap, V.B., Speed, T. (2005) Rooting a phylogenetic tree with nonreversible substitution models. BMC Evolutionary Biology 5, 2.
spis treści

Inne moje projekty: